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哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

更新時(shí)間:2023-06-12      點(diǎn)擊次數(shù):1382

哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解物中 GFP 融合蛋白的免疫沉淀 (IP/CoIP) 方案

該方案旨在對(duì) GFP 標(biāo)記的融合蛋白進(jìn)行免疫沉淀,以通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡或活性測(cè)定進(jìn)行分析。
溶液和試劑
1X 細(xì)胞裂解緩沖液:50 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100。建議在使用前添加 1 mM PMSF。
1X 洗滌緩沖液:TBS(50 mM Tris HCl,150 mM NaCl,pH 7.5)
5X SDS 上樣緩沖液
1. 準(zhǔn)備細(xì)胞裂解物
1. 要在非變性條件下收獲細(xì)胞,去除培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 沖洗細(xì)胞一次。去除 PBS 并向每個(gè)板(10 cm,106-107 個(gè)細(xì)胞)中加入 0.5 mL-1mL 1X 冰冷細(xì)胞裂解緩沖液(添加蛋白酶抑制劑混合物和 PMSF),并將板在冰上孵育 30-40 分鐘,4 °旋轉(zhuǎn)攝氏度。
2. 從平板上刮下裂解的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到微量離心管中。繼續(xù)冰上。
3. 在冰上對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理 3 次,每次 5 秒(可選步驟)。
4. 4°C、14,000 xg 微量離心 10 分鐘,將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。如有必要,可將裂解物儲(chǔ)存在 –80°C 下。
注意:如果目的蛋白是核蛋白,請(qǐng)使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,并加入PIC、1mM PMSF、2.5mM Mgcl2和1mg/ml DNase I。
2. 平衡珠子
1. 顛倒產(chǎn)品管或輕輕上下吹打以重懸珠子。不要渦旋珠子。
2. 吸取 25 µL 珠漿到 EP 管(1.5 mL)中,然后加入 1 mL 冰冷的洗滌緩沖液。用手輕輕搖晃 1-2 分鐘。不要渦旋珠子。
3、磁選60秒。
4. 棄去上清,重復(fù)洗滌 3 次。
3. 免疫沉淀
1. 取 500 μL 細(xì)胞裂解液,加入 25 μL 抗體偶聯(lián)磁珠懸液,4°C 孵育 1-3 小時(shí)或 4°C 過(guò)夜。
4. 清洗蛋白質(zhì)-納米抗體-珠復(fù)合體
注意:如果研究了 Co-IP 相互作用的蛋白質(zhì),請(qǐng)減少洗滌次數(shù),并降低洗滌緩沖液的離子強(qiáng)度。
加入 1.0 mL 的 Wash Buffer 并懸浮珠子復(fù)合物,磁選,然后棄去上清液。重復(fù)上述步驟至少四次。
5. 下游分析的洗脫
GFP 融合蛋白的洗脫-根據(jù)蛋白質(zhì)特性或進(jìn)一步用途推薦兩種洗脫方法:
選項(xiàng) A:天然洗脫
在酸性條件下用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脫。這是一種快速有效的洗脫方法。用中和緩沖液(1 M Tris,pH 10.4)中和洗脫的蛋白質(zhì)可能有助于保持其活性。中和緩沖液需要預(yù)先放入收集管中。
注意:需提前做初步實(shí)驗(yàn),確定中和甘氨酸(PH 2.5)需要多少中和緩沖液
選項(xiàng) B:SDS-PAGE 的變性洗脫
在凝膠電泳和免疫印跡的變性條件下用樣品上樣緩沖液洗脫。
A:用 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5) 洗脫 - 該過(guò)程應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
注意:不要將珠子留在該緩沖液中超過(guò) 20 分鐘。
1. 向每個(gè)樣品和對(duì)照珠復(fù)合物中加入 50 µL 0.2 M 甘氨酸 (pH 2.5)。
2. 在 4°C 下輕輕搖動(dòng)或在旋轉(zhuǎn)器上孵育樣品和對(duì)照 5-10 分鐘。
3. 將試管放入磁力分離器中以收集珠子。將上清液轉(zhuǎn)移到含有 25-35 μL 中和緩沖液的新管中。小心不要轉(zhuǎn)移任何珠子。
4. 重復(fù)步驟 1-3 以提高洗脫效率,將洗脫液集中在同一管中或通過(guò)不同管收集洗脫液。
6. 如需立即使用,請(qǐng)將洗脫液儲(chǔ)存在 2-8 °C。儲(chǔ)存在 –20 °C 以進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
B:用 SDS-PAGE 上樣緩沖液洗脫
1. 用 30 µL 1X SDS 樣品上樣緩沖液重懸每個(gè)樣品(6 µL 5X SDS 樣品上樣緩沖液可以添加到 24 µL 細(xì)胞裂解緩沖液中)。渦流。
2. 在 95 – 100°C 下將樣品管和對(duì)照管煮沸 10 分鐘。
3. 將試管放入磁力分離器中以收集珠子。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。樣品和對(duì)照已準(zhǔn)備好加載到 SDS-PAGE 上,并使用抗 GFP 或針對(duì)融合蛋白的特異性抗體進(jìn)行免疫印跡。



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