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混合技術(shù)利用 Ni-NTA-Nanogold® 闡明亞蛋白結(jié)構(gòu), 揭示關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制

更新時(shí)間:2023-10-08      點(diǎn)擊次數(shù):692

迄今為止,許多生命過程背后的確切機(jī)制仍然難以捉摸,因?yàn)槲覀儭坝^察"蛋白質(zhì)微小部分及其相互作用的方法受到限制?,F(xiàn)在,一種新的混合技術(shù)利用了電子顯微鏡、納米技術(shù)、復(fù)雜的圖像處理和 3D 繪圖軟件以及標(biāo)記和測量蛋白質(zhì)的方法的力量。突破性的方法是從讀取 DNA 本身的物理啟動(dòng)開始,揭示我們最微小的運(yùn)動(dòng)部件的結(jié)構(gòu)和功能。

轉(zhuǎn)錄對(duì)于細(xì)胞基因的表達(dá)至關(guān)重要,即“讀取"DNA 片段以開始產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。其中一個(gè)關(guān)鍵角色是 RNA 聚合酶 II(RNAPII),它是一種從起始 DNA 合成信使 RNA 的納米機(jī)器。同樣重要的是它的助手 TFIIF,它可以識(shí)別 DNA 啟動(dòng)子并向 RNAPII 發(fā)出信號(hào),從哪里開始讀取一定長度的遺傳密碼。到目前為止,這對(duì)動(dòng)態(tài)二人組相互作用背后的機(jī)制仍然難以捉摸,因?yàn)樘《鵁o法可視化。

在中國臺(tái)灣,Wei-hau Chang 博士和他的團(tuán)隊(duì)開創(chuàng)了一種混合技術(shù),對(duì)這些重要蛋白質(zhì)復(fù)合物的解剖結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了深入的認(rèn)識(shí)。他們超越了冷凍電鏡和 X 射線晶體學(xué)的界限,使用一種新穎的電子顯微鏡成像技術(shù)進(jìn)行單顆粒分析,然后通過 FRET 分析進(jìn)行微小測量,以進(jìn)一步提高其繪圖的精度。他們的發(fā)現(xiàn)不僅解開了 TFIIF 在 RNAPII 上的位置之謎,而且還揭示了這些是移動(dòng)部件,發(fā)生戲劇性的轉(zhuǎn)變以與 DNA 結(jié)合——讓我們第一次看到基因轉(zhuǎn)錄的物理起始過程。

當(dāng)他們著手研究由 TFIIF 和 RNAPII 形成的 DNA 讀取復(fù)合物的結(jié)構(gòu)時(shí),Chang 等人。需要用更明顯的標(biāo)簽來標(biāo)記難以看到的蛋白質(zhì),然后可以用它來確定它們的確切位置。他們首先用 Nanogold®(一種單一的金納米顆粒)標(biāo)記 TFIIF 蛋白的末端;黃金的電子密度很高,因此在電子顯微鏡下會(huì)顯得明亮。該團(tuán)隊(duì)利用酵母中的基因表達(dá)技術(shù),在 TFIIF 上創(chuàng)建了帶有 10 個(gè)組氨酸的 TAP 標(biāo)簽,然后該標(biāo)簽與 Nickel-NTA-Nanogold ® (Nanoprobes Inc.)緊密結(jié)合,為他們的 EM 工作提供了清晰的標(biāo)記。

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分析的第一階段結(jié)合了兩種成像方法和電子顯微鏡。更加散焦的視圖實(shí)際上增加了與較大物體的對(duì)比度,從而使蛋白質(zhì)復(fù)合物整體成形;對(duì)于這組圖像,該小組使用了更大的 5 nm Ni-NTA-Nanogold 標(biāo)記物。接下來,使用高度聚焦的圖像清晰地識(shí)別出單個(gè)微小的金納米顆粒;在這里,該小組使用 1.8 nm Ni-NTA-Nanogold 以最高精度標(biāo)記他們的目標(biāo)。兩個(gè)視圖共同形成了一幅圖像,顯示了微小 TFIIF 轉(zhuǎn)錄起始子的位置,以及它如何融入更大的 RNAPII 轉(zhuǎn)錄機(jī)器。軟件分析了數(shù)千個(gè)圖像對(duì),創(chuàng)建了詳細(xì)的蛋白質(zhì) 3D 圖譜。

第二階段的分析使用 FRET 分析帶來了更高的精度。在這里,熒光“發(fā)射機(jī)"標(biāo)記被放置在 RNAPII 轉(zhuǎn)錄機(jī)上的穩(wěn)定點(diǎn),“受體"標(biāo)記被放置在 TFIIF 蛋白上。一段時(shí)間后,接收器收集到的能量可以用來計(jì)算其與發(fā)射器的準(zhǔn)確距離。對(duì)許多樣品的分析進(jìn)一步完善了 TFIIF 蛋白在 RNAPII 復(fù)合物上的定位,結(jié)合 EM 數(shù)據(jù)創(chuàng)建了詳細(xì)的圖譜。

然而,Chang 的團(tuán)隊(duì)所做的遠(yuǎn)不止簡單地繪制這些蛋白質(zhì)的孤立結(jié)構(gòu)。他們還展示了帶有基因序列的起始前轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,并使用他們的方法來檢查 TFIIF 起始子在遇到 DNA 啟動(dòng)子時(shí)的定位。他們發(fā)現(xiàn) TFIIF 會(huì)做出劇烈的物理運(yùn)動(dòng)作為響應(yīng),這實(shí)際上將 DNA 移向 RNAPII 轉(zhuǎn)錄機(jī)的葉/突出區(qū)域。這可能代表了轉(zhuǎn)錄起始位置的動(dòng)力學(xué)選擇,并且是在行動(dòng)中觀察到的基本生命過程開始背后機(jī)制的第一個(gè)視圖。

作者寫道:“我們相信這種方法對(duì)于研究許多蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)通常很有用。"他們將他們的兩步過程比作“用谷歌地圖放大"。事實(shí)上,張的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)找到了一種方法來“看到"我們至關(guān)重要的納米機(jī)械中極其微小的部分,從而可以真正了解它們?cè)趧?chuàng)造和支持生命本身時(shí)的相互作用和功能。

“這種結(jié)合了多種技術(shù)的新技術(shù)確實(shí)為更深入地了解細(xì)胞過程如何工作打開了大門," Nanoprobes 的科學(xué)家James F. Hainfeld 博士說,該公司是Chang 技術(shù)中使用的Ni-NTA-Nanogold ®的制造商。 “這是一個(gè)以高分辨率繪制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)圖的好工具。"

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