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RNAstorm™ FFPE 套件常見問題

更新時(shí)間:2023-10-08      點(diǎn)擊次數(shù):626
使用 RNAstorm™ 試劑盒獲得的 RNA 中是否存在任何污染的基因組 DNA?

基因組 DNA 的污染是一個(gè)大問題,因?yàn)樗鼤?huì)干擾下游應(yīng)用。 RNAstorm™ 試劑盒包括優(yōu)化的 DNase 消化步驟,可去除污染的基因組 DNA,而不顯著影響 RNA 產(chǎn)量。雖然此步驟是可選的,但強(qiáng)烈建議這樣做。

我期望從 FFPE 樣品中獲得多少 RNA?

影響獲得的RNA總量的最大變量是樣品本身的質(zhì)量(即組織的類型和數(shù)量,以及樣品分離和保存的注意事項(xiàng))。使用 RNAstorm™ 試劑盒,并假設(shè)至少合理的樣品質(zhì)量,可以獲得大于 1 µg 的量。

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA可以用于RNA-Seq嗎?

是的。只要 RNA 的質(zhì)量足夠高,就可以獲得高質(zhì)量的文庫(kù)。對(duì)于 Illumina 測(cè)序,建議 DV200 至少為 30%,并且應(yīng)使用提供至少 1 µg RNA 的樣品。

組織應(yīng)該如何準(zhǔn)備?

使用切片機(jī)從 FFPE 樣品中獲取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割,可以使用小于 5 µm 的切片。不建議使用厚度超過 10 µm 的切片,因?yàn)樗鼈兛赡軣o法全消化。此外,每次提取應(yīng)使用不超過 5 個(gè)切片(每個(gè) 10 µM)。使用過多的組織會(huì)導(dǎo)致消化不全并降低產(chǎn)量。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎?

是的,可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下,我們建議機(jī)械研磨相當(dāng)于推薦切片數(shù)量的組織。

我可以使用 FFPE 芯嗎?

是的,可以使用 FFPE 芯材。由于核心不使用切片機(jī)進(jìn)行處理,因此樣品消化往往更加困難,如果觀察到消化不全,建議使用機(jī)械均質(zhì)化(例如使用鋼珠)。

您推薦哪種脫蠟方法?

RNAstorm™ 試劑盒包含推薦的脫蠟試劑。與其他常見方法(例如二甲苯)不同,脫蠟試劑高效、無毒,并且不需要使用通風(fēng)柜。在我們的測(cè)試中,所包含的試劑在去除石蠟和純化高質(zhì)量核酸方面至少與二甲苯一樣有效。

定量從 FFPE 樣品中獲得的 RNA 的最佳方法是什么?

與從新鮮樣品中獲得的 RNA 相比,準(zhǔn)確定量 FFPE 衍生的 RNA 更具挑戰(zhàn)性。僅僅知道存在的 RNA 的絕對(duì)量是不夠的,還要知道 RNA 是否會(huì)在下游應(yīng)用中發(fā)揮作用,這取決于以下因素:

  • 片段大小分布:如果 5 µg 樣品(通過 Qubit 測(cè)量)包含 < 200 nt 的片段,則它對(duì)于 RNA-Seq 可能毫無用處。

  • 化學(xué)修飾:對(duì)于從福爾馬林固定的樣品中獲得的RNA,各種化學(xué)加合物和交聯(lián),包括堿基修飾、堿基-堿基交聯(lián)和堿基-蛋白質(zhì)交聯(lián),可以使核酸分子無法被酶接觸,從而在下游應(yīng)用中失活。

  • 污染:純化過程中使用的細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、鹽和洗滌劑可能會(huì)導(dǎo)致下游檢測(cè)產(chǎn)生偏差。例如,Nanodrop 等基于 UV/Vis 的方法特別容易受到 200-280 nm 范圍內(nèi)吸收的污染物的影響。

  • 基于熒光的方法(例如 Qubit)容易出現(xiàn)重大錯(cuò)誤。當(dāng)使用低濃度的 DNA 或 RNA 時(shí),基于染料的檢測(cè)可能不是線性的。還必須注意 RNA 樣品中基因組 DNA 的污染,因?yàn)橛糜跓晒舛康娜玖喜⒉蝗槍?duì) FFPE 衍生的 DNA 或 RNA。

  • 定量 PCR 是定量嚴(yán)重受損和修飾核酸的方法。

是否應(yīng)該使用 RIN 編號(hào)來確定 FFPE 衍生 RNA 的質(zhì)量?

盡管 RIN 數(shù)可以提供有關(guān)樣品碎片程度的一般信息,但它不夠靈敏或可預(yù)測(cè),不足以成為下游性能的有用指標(biāo),尤其是對(duì)于 RNA-Seq。通常,F(xiàn)FPE 衍生 RNA 的 RIN 編號(hào)在 2 到 3 之間。其中一些樣本對(duì) RNA-Seq 有用,而另一些則不會(huì)——但是,RIN 不會(huì)告訴您。

使用 Illumina 測(cè)序的 RNA-Seq性能預(yù)測(cè)指標(biāo)稍好一些的是 DV200,它代表長(zhǎng)度超過 200 個(gè)核苷酸的 RNA 片段的百分比。 DV200 也是基于生物分析儀數(shù)據(jù)計(jì)算的,但與所有基于生物分析儀的方法具有相同的缺點(diǎn),特別是高變異性。

從 FFPE 樣品中提取 RNA 時(shí)我需要了解什么?
  • 避免基于有機(jī)溶劑 (Trizol) 的方法

  • 避免刺激性離液鹽(即胍鹽)

  • 避免使用影響 UV 和/或 Qubit 下游定量的清潔劑(例如 Triton X-100)

  • 請(qǐng)勿依賴 RIN 來定量 FFPE 衍生樣品的完整性。看看為什么。請(qǐng)改用 DV200。

  • 使用去除福爾馬林化學(xué)修飾的試劑盒或方法。請(qǐng)勿將溫度升至 80°C 或以上。即使在此溫度下停留很短的時(shí)間也會(huì)顯著降低完整性。

  • 請(qǐng)警惕 Qubit 和 Nanodrop 濃度,因?yàn)榭赡軙?huì)受到有機(jī)分子或 DNA 污染。

  • 使用 qPCR 定量 RNA,并始終仔細(xì)觀察熔解曲線以確定是否發(fā)生非特異性擴(kuò)增。


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