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DNAstorm™ FFPE 套件常見問題

更新時間:2023-10-08      點(diǎn)擊次數(shù):612
使用 DNAstorm™ 試劑盒獲得的 DNA 中是否存在污染 RNA?

通過在裂解步驟后立即執(zhí)行優(yōu)化的 RNase 消化步驟來消除 RNA 污染。

我預(yù)計(jì)可以從 FFPE 樣本中獲得多少 DNA?

影響獲得的 DNA 總量的最大變量是樣本本身的質(zhì)量(即組織的類型和數(shù)量,以及樣本分離和保存的注意事項(xiàng))。使用 DNAstorm™ 試劑盒,并假設(shè)樣品質(zhì)量至少合理,可以獲得大于 1 µg 的量。

使用 DNAstorm™ 試劑盒獲得的 DNA 可以用于下一代測序嗎?

是的。只要 DNA 的質(zhì)量足夠高,就可以獲得高質(zhì)量的文庫。

組織應(yīng)該如何準(zhǔn)備?

使用切片機(jī)從 FFPE 樣品中獲取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割,可以使用小于 5 µm 的切片。不建議使用厚度超過 10 µm 的切片,因?yàn)樗鼈兛赡軣o法全消化。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎?

是的,可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下,我們建議機(jī)械研磨相當(dāng)于推薦切片數(shù)量的組織。

我可以使用 FFPE 芯嗎?

是的,可以使用 FFPE 芯材。由于核心不使用切片機(jī)進(jìn)行處理,因此樣品消化往往更加困難,如果觀察到消化不全,建議使用機(jī)械均質(zhì)化(例如使用鋼珠)。

您推薦哪種脫蠟方法?

DNAstorm™ 試劑盒包含推薦的脫蠟試劑。與其他常見方法(例如二甲苯)不同,脫蠟試劑高效、無毒,并且不需要使用通風(fēng)柜。在我們的測試中,所包含的試劑在去除石蠟和純化高質(zhì)量核酸方面至少與二甲苯一樣有效。

將脫蠟試劑與 CAT5 裂解緩沖液混合后,我看到脫蠟試劑層和水層之間有白色混濁層。這是什么以及它如何影響提取?

白色混濁層是脫蠟試劑和 CAT5 裂解緩沖液之間的乳液,當(dāng)這兩種試劑渦旋或硬混時可能會形成。為避免此問題,我們建議在脫蠟試劑和 CAT5 裂解緩沖液接觸時不要渦旋樣品。當(dāng)需要在這兩種試劑存在的情況下混合時(例如添加蛋白酶時),我們建議使用移液器混合。通過以最大速度 (> 16,000 xg) 強(qiáng)力旋轉(zhuǎn)樣品至少 2 分鐘,可以去除白色渾濁層。時間長短取決于乳液的體積。

如何評估我獲得的 DNA 的完整性?

由于從 FFPE 組織樣品中分離出的 DNA 尺寸分布廣泛,我們建議使用脈沖場凝膠電泳 (PFGE)。也可以使用基于毛細(xì)管電泳的方法,例如安捷倫生物分析儀,但可能無法正確解析質(zhì)量較好的樣品中的高分子量片段(大于 10k)。

為什么我提取的 DNA 無法正常擴(kuò)增?我注意到很多 PCR 抑制和/或 Ct 值毫無意義。

當(dāng)使用大量 FFPE 提取的模板 DNA 時,經(jīng)常會觀察到 PCR 抑制。這種抑制通常不是由于污染物的存在,而是由于 DNA 本身的殘留化學(xué)修飾和損傷造成的。對 PCR 方案進(jìn)行一些簡單的調(diào)整就可以解決這個問題。首先,應(yīng)減少模板DNA的量。其次,PCR 聚合酶的量應(yīng)增加 2-4 倍。第三,應(yīng)延長退火和延伸時間。第四,可以增加dNTP的量。


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